Приложение №1

Лабораторная работа

 «Изучение каталитической активности  каталазы

в живых и вареных тканях»

Бланк отчета ........................................................................................................................(ФИО, класс)

         Фермент каталаза катализирует расщепление пероксида водорода (Н₂О₂) с образованием молекул воды и кислорода. 2H₂O₂ = 2H₂O + O_2.  Этот фермент находится в растительных и животных тканях.

<!--[if gte vml 1]> <![endif]--><!--[if !vml]--><!--[endif]-->

<!--[if gte vml 1]> <![endif]--><!--[if !vml]--><!--[endif]--><!--[if gte vml 1]> <![endif]--><!--[if !vml]--><!--[endif]--><!--[if gte vml 1]> <![endif]--><!--[if !vml]--><!--[endif]-->

Ферменты (определение)–

Цель данной работы (глагольное существительное)–  

Задачи (глаголы неопределенной формы):

1.

2.

3.

Проблема (вопрос, на который надо ответить в ходе эксперимента)

Объект изучения (предмет или явление, на которое направлено исследование)– 

Предмет (сторона, свойство объекта)–

Номер пробы и какая ткань взята для опыта:

Скорость выделения O₂ будем вычислять по формуле:

Uр.= (V_M*( ω₂- ω₁)/t)/100% , где:

V_M- молярный объем, численно равный 22.4 л/моль,

t- время проведения эксперимента,

ω₁- процентное содержание кислорода в воздухе в начале эксперимента,

ω₂- процентное содержание кислорода в воздухе в конце эксперимента

Гипотезы (предполагаем, возможно):

Оборудование:

Результаты исследований и их объяснение:

Таблица, отражающая количество кислорода до и после опыта

Сделайте вывод об активности и содержании ферментов, ответив на следующие вопросы:

1. В каких тканях – растительных или животных – активнее ферменты?

2. В каких тканях – сырых или вареных – активнее ферменты? Как вы объясните результат?

{C}<!--[if !supportLists]-->3.{C}<!--[endif]--> Какие факторы влияют на активность ферментов?

Вывод:

Домашнее задание: ответьте на вопросы ЕГЭ части С:

1. Что из себя представляют ферменты?

2. Каково значение ферментов? Назовите области применения ферментов. 

3. Подумайте, почему пероксид водорода используют для дезинфекции ран, ссадин и полости рта. 

4. В чем заключается специфичность действия ферментов?

5. В чем заключается нейрогуморальная регуляция выделения желудочного сока?

Результаты исследований и их объяснение:

Сводная таблица, отражающая количество кислорода до и после опыта

Инструктаж по выполнению лабораторной работы

«Изучение каталитической активности  каталазы в живых и вареных тканях»

Введение. В клетке постоянно идут тысячи реакций. Если смешать в пробирке органические и неорганические вещества точно в тех же соотношениях, что и в живой клетке, но без ферментов, то почти никаких реакций с заметной скоростью идти не будет. Именно благодаря ферментам реализуется генетическая информация и осуществляется весь обмен веществ. Во всех живых организмах постоянно протекают химические реакции синтеза и распада. Все они сопровождаются особыми химическими веществами – ферментами. Ферменты являются глобулярными белками и действуют как катализаторы ― вещества, ускоряющие химические реакции. При этом ферменты не разрушаются и не видоизменяются. Ферменты чрезвычайно эффективны и могут использоваться много раз. Один фермент может катализировать тысячи реакций в каждую секунду.

Изучение свойств ферментов чрезвычайно актуально в последнее время, так как они получили большую популярность во многих отраслях народного хозяйства. Применение ферментных препаратов в ряде отраслей промышленности обеспечивает значительное ускорение технологических процессов, улучшает качество и повышает сортность продуктов, снижает расход сырья, увеличивает выход готовой продукции, улучшает условия труда, повышает его производительность и в ряде производств позволяет перевести технологические процессы на непрерывный поток.

К настоящему времени известно более 2 тыс. ферментов, и их количество продолжает расти. Многие из них выделены из живых клеток и получены в чистом виде.

Данная работа посвящена изучению свойств одного из ферментов - каталазы, а также определению факторов, влияющих на ее ферментативную активность. Фермент каталаза катализирует расщепление пероксида водорода (Н₂О₂) с образованием молекул воды и кислорода. 2H₂O₂ = 2H₂O + O₂

Активность каталазы измерялась по скорости разложения пероксида водорода и по количеству кислорода, выделяемого в этой реакции. Количество кислорода определяли с помощью УИОД LabQuest Vernier - устройства измерения и обработки данных и датчика содержания O₂

 В начале каталитической реакции не происходит выделения продуктов и концентрация кислорода такая же, как и в атмосфере. Через короткий промежуток времени начинает выделяться кислород с постоянной скоростью. Концентрация кислорода увеличивается прямо пропорционально времени реакции.   

По мере разложения пероксида водорода все меньшее его количество может вступать в реакцию, в результате O₂ выделяется с меньшей скоростью.

Оборудование: УИОД - устройство измерения и обработки данных, ПО LabQuest App, датчик содержания O2,  3 пробирки (18×150 мм), колба (250 мл, входит в комплектацию датчика)

Реактивы: 3 %-ный раствор пероксида водорода H2O2 (20 мл), дистиллированная вода (20 мл)

Суспензия, содержащая каталазу (50 мл)  или навеска тканей

Выполнение работы

{C}<!--[if !supportLists]-->1.                        <!--[endif]-->Ознакомьтесь с общими правилами техники безопасности проведения практических работ в кабинете биологии.

{C}<!--[if !supportLists]-->2.                        <!--[endif]-->Подготовьте датчик содержания O₂ для проведения опыта.

{C}<!--[if !supportLists]-->3.                        <!--[endif]--><!--[if gte vml 1]> <![endif]--><!--[if !vml]--><!--[endif]-->Подключите датчик к УИОД. В меню Файл выберите пункт Новый. Если все сделано правильно, датчик определится автоматически, и на экране устройства вы увидите показания датчика.

{C}<!--[if !supportLists]-->4.            <!--[endif]-->Измените Частоту замеров датчика на 0,2 Гц и Время эксперимента на 180 с.

{C}<!--[if !supportLists]-->5.            <!--[endif]-->Установите три пробирки в штативе и обозначьте их цифрами 1, 2 и 3. В каждую пробирку прилейте 5 мл 3 %-ного раствора H₂O₂ и 5 мл воды.

{C}<!--[if !supportLists]-->6.            <!--[endif]-->Начните реакцию катализации. Для этого:

{C}<!--[if !supportLists]-->a)            <!--[endif]-->используя чистую пипетку, добавьте 5 капель суспензии в пробирку № 1;

{C}<!--[if !supportLists]-->b)            <!--[endif]-->начните отсчет времени, используя секундомер или часы;

{C}<!--[if !supportLists]-->c)            <!--[endif]-->закройте пальцем отверстие пробирки и дважды переверните ее;

{C}<!--[if !supportLists]-->d)            <!--[endif]-->влейте содержимое пробирки в чистую колбу;

{C}<!--[if !supportLists]-->e)            <!--[endif]-->поместите датчик содержания O₂ в колбу до упора, как показано на рисунке. Датчик должен герметично закрывать колбу, причем это можно сделать без особого усилия;

{C}<!--[if !supportLists]-->f)             <!--[endif]-->через 30 с запустите процесс измерения. Нажмите кнопку {C}<!--[if gte vml 1]> <![endif]-->{C}<!--[if !vml]-->{C}<!--[endif]-->. Сбор данных  прекратится автоматически через 180 с.

{C}<!--[if !supportLists]-->7.            <!--[endif]-->После завершения первого опыта аккуратно удалите датчик содержания  O₂ из колбы. Промойте колбу водой и вытрите бумажной салфеткой.

{C}<!--[if !supportLists]-->8.                  <!--[endif]-->Подберите оптимальную прямую линию, отображающую начальную скорость реакции (угловой коэффициент):

{C}<!--[if !supportLists]-->a)                  <!--[endif]-->в меню Анализ выберите пункт Подбор кривой;

{C}<!--[if !supportLists]-->b)                  <!--[endif]-->в элементе управления Тип функции выберите пункт Линейная. Если все сделано правильно, рядом с графиком зависимости концентрации кислорода от времени будет построена прямая линия;

{C}<!--[if !supportLists]-->c)                  <!--[endif]-->подтвердите выбор прямой;

{C}<!--[if !supportLists]-->d)                  <!--[endif]-->запишите в таблицу отчета значение углового коэффициента m для данного графика.

{C}<!--[if !supportLists]-->9.                  <!--[endif]-->Сохраните экспериментальные данные. Нажмите кнопку  {C}<!--[if gte vml 1]> <![endif]-->{C}<!--[if !vml]-->{C}<!--[endif]-->.

{C}<!--[if !supportLists]-->10.              <!--[endif]--> Повторите опыт, используя пробирки № 2 и 3:

{C}<!--[if !supportLists]-->a)            <!--[endif]-->добавьте 10 капель раствора, содержащего фермент, в пробирку № 2. Повторите пп. 6―9;

{C}<!--[if !supportLists]-->b)            <!--[endif]-->добавьте 20 капель раствора, содержащего фермент, в пробирку № 3. Повторите пп. 6―8.

11. Постройте все три графика зависимости на одной координатной плоскости. Для этого в правом углу экрана нажмите кнопку Все опыты (All Runs).

12. Распечатайте полученный результат. Для этого в меню Файл выберите пункт Печать, затем пункт График. Подпишите графики.

13. Сравните полученные результаты. Ответьте на контрольные вопросы.

14. Сделайте вывод и заполните бланк отчета.

Общие сведения о ферментах

1. Определения. Ферменты – это биологические катализаторы белковой природы, которые образуются в живых клетках и обладают способностью активировать различные химические соединения. Характеристикой активности ферментов является скорость, с которой они катализируют ту или иную реакцию. Она измеряется скоростью превращения субстрата или скоростью накопления продуктов реакции. Измерять нужно начальную скорость превращения, а не количество субстрата, превращенного за определенный отрезок времени.

Каталаза: (от греч. Katalуo — разрушаю), фермент из группы гидропероксидаз, катализирующий окислительно-восстановительную реакцию, в ходе которой из 2 молекул перекиси водорода образуются вода и кислород: курса химии вам известно, что такое катализатор. Это вещество, которое ускоряет реакцию, оставаясь в конце реакции неизменным (не расходуясь). Биологические катализаторы называются ферментами (от лат. fermentum – брожение, закваска), или энзимами.

  Впервые высокоочищенный кристаллический фермент был выделен в 1926 г. американским биохимиком Дж. Самнером. Этим ферментом была уреаза, которая катализирует расщепление мочевины.

Ферменты обладают всеми свойствами белков. Однако по сравнению с белками, выполняющими другие функции в клетке, ферменты имеют ряд специфических, присущих только им свойств.

Для названия большинства ферментов характерен суффикс - аза, который чаще всего прибавляется к названию субстрата – вещества, с которым взаимодействует фермент.

2. Строение ферментов

По сравнению с молекулярной массой субстрата ферменты имеют гораздо большую массу. Такое несоответствие наводит на мысль, что не вся молекула фермента участвует в катализе. Чтобы разобраться в этом вопросе, необходимо познакомиться со строением ферментов.

По строению ферменты могут быть простыми и сложными белками. Во втором случае в составе фермента кроме белковой части (апофермент) имеется добавочная группа небелковой природы – активатор (кофактор, или кофермент), вследствие чего образуется активный голофермент. Белковая часть и небелковый компонент в отдельности лишены ферментативной активности, но, соединившись вместе, приобретают характерные свойства фермента.

{C}<!--[if gte vml 1]> <![endif]-->{C}<!--[if !vml]-->{C}<!--[endif]-->В белковой части ферментов содержатся уникальные по своей структуре активные центры, представляющие собой сочетание определенных аминокислотных остатков, строго ориентированных по отношению друг к другу (в настоящее время структура активных центров ряда ферментов расшифрована). Активный центр взаимодействует с молекулой субстрата с образованием «фермент-субстратного комплекса». Затем «фермент-субстратный комплекс» распадается на фермент и продукт или продукты реакции.

Рис.1 Модель фермента, отражающая принцип действия ферментов

3. Свойства ферментов

Зависимость активности ферментов от температуры

Температура может влиять по-разному на активность фермента. При высоких значениях температуры может происходить денатурация белковой части фермента, что негативно сказывается на его активности. При определенных (оптимальных) значениях температура может влиять на скорость образования фермент-субстратного комплекса, вызывая увеличение скорости реакции. Температура, при которой каталитическая активность фермента максимальна, называется температурным оптимумом фермента. Различные клеточные ферменты имеют собственные температурные оптимумы, которые определяются экспериментально. Для ферментов животного происхождения температурный оптимум находится в интервале 40 - 50°С.

Известно несколько исключений из этого правила. Некоторые виды примитивных растений — сине-зеленых водорослей — живут в горячих источниках, например в источниках Йеллоустонского национального парка, где температура воды достигает почти 100° С. Эти водоросли обусловливают яркую окраску травертиновых террас вокруг горячих источников. При температурах ниже той, при которой наступает инактивация ферментов (около 40° С), скорость большинства ферментативных реакций, как и скорость других химических реакций, примерно удваивается с повышением температуры на каждые 10° С.

Замораживание обычно не приводит к инактивации ферментов; при низких температурах ферментативные реакции идут очень медленно или не идут вовсе, но при повышении температуры до нормальной каталитическая активность возобновляется.

Зависимость активности фермента от рН-среды

Большинство ферментов проявляет максимальную активность при значениях рН, близких к нейтральным. Лишь отдельные ферменты "работают" в сильно кислой или сильно щелочной среде. Например, активность пепсина - фермента, гидролизующего белки в желудке, - максимальна при рН 1,5 - 2,5. В щелочной среде "работают" ферменты, локализованные в кишечнике. Изменение оптимального для данного фермента значения рН-среды может привести к изменению третичной структуры фермента, что скажется на его активности . 

Специфичность действия ферментов - одно из главных их свойств. Специфичность - это избирательность фермента по отношению к субстрату (или субстратам). Специфичность действия ферментов объясняется тем, что субстрат должен подходить к активному центру как "ключ к замку". Это образное сравнение сделано Э.Фишером в 1894 г. Он рассматривал фермент как жесткую структуру, активный центр которой представляет собой "слепок" субстрата. Однако этой гипотезой трудно объяснить групповую специфичность ферментов, т.к. конфигурация "ключей" (субстратов), подходящих к одному "замку", слишком разнообразна (рис.1). Такое несоответствие получило объяснение в 50-е гг. XX в. в гипотезе Д. Кошланда. Она получила название гипотезы "вынужденного соответствия".

В момент присоединения  субстрат "вынуждает" активный центр фермента принять соответствующую форму. Это можно сравнить с "перчаткой" и "рукой". Гипотеза "вынужденного соответствия" получила экспериментальное подтверждение. Эта гипотеза позволяет также объяснить причину превращения близких аналогов субстратов.

Влияние на активность ферментов активаторов и ингибиторов

К числу факторов, повышающих активность ферментов, относятся катионы металлов и некоторые анионы. Чаще всего активаторами ферментов являются катионы Mg²+, Mn²+, Zn²+, K+ и Со²+, а из анионов - Сl-. Катионы действуют на ферменты по-разному. В одних случаях они облегчают образование фермент-субстратного комплекса, в других - способствуют присоединению кофермента к апоферменту, либо присоединяются к аллостерическому центру фермента и изменяют его третичную структуру, в результате чего субстратный и каталитический центры приобретают наиболее выгодную для осуществления катализа конфигурацию.

 Ингибиторы тормозят действие ферментов. Ингибиторами могут быть как эндогенные, так и экзогенные вещества. Механизмы ингибирующего действия различных химических соединений разнообразны.

    Использование ферментов в народном хозяйстве

Ферменты как катализаторы многих биохимических процессов находят применение в различных отраслях промышленности, медицине, быту и сельском хозяйстве. Применение ферментов особенно эффективно в пищевой и легкой промышленности, а также в животноводстве. При добавлении небольшого количества ферментов к перерабатываемому сырью интенсифицируются многие технологические процессы, повышаются производительность аппаратуры и степень использования сырья, улучшается качество готовой продукции и уменьшается ее стоимость.

Использование ферментов плесневых грибов в спиртовом производстве для замены солода повышает выход спирта из перерабатываемого сырья на 0,5—0,6% и уменьшает его стоимость.

В пивоваренной промышленности применение ферментов позволяет увеличить использование несоложеного сырья в производстве на 30 - 40% При этом выход пива увеличивается на 15 дал. на 1 т зернового сырья. Применение протеолитических ферментов для стабилизации пива увеличивает срок его хранения и улучшает качество пива.

В плодово-ягодном виноделии применение пектолитических препаратов ферментов повышает выход соков из сырья на 15—20%. При обработке пектолитическими ферментами виноградного сырья увеличивается выход виноматериалов на 5%, ускоряется и улучшается процесс фильтрования вина [10].

Выход яблочного сока при обработке сырья пектолитическими ферментами увеличивается на 10%.

Ферменты, выделенные из клеток микроорганизмов (плесневых грибов, бактерий, дрожжей, актиномицетов), сохраняют свои специфические свойства и вызывают вне живой клетки те же превращения, что и в живой клетке. На этом свойстве ферментов основано использование их в народном хозяйстве.

Применение в медицине. Расщепляя Н₂О₂, каталаза играет защитную роль. Она обезвреживает ядовитое вещество (пероксид водорода), которое непрерывно образуется в клетке в процессе жизнедеятельности. Активность фермента очень высока: при 0 °С – 1 молекула катализатора разлагает за 1 секунду до 40 000 молекул Н₂О₂.