Муниципальноек казенное общеобразовательное учреждение средняя общеобразовательная школа №1  Чулымского района

ФЛАВОНОИДЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛАТОК (кислотно-щелочные индикаторы природного происхождения)

Автор: Екимова  Оксана

Барсукова Екатерина

МКОУ СОШ №1 9 класс

Г. Чулым

Научный руководитель:

                                                                                Черкасова Елена  Михайловна,

учитель химии и биологии,

высшей квалификационной категории

контактный телефон: 8-913-981-62-64

Г Чулым, 2013

СОДЕРЖАНИЕ

Введение:

Слово «цветок» произошло от слова «цвет», «небольшой кусочек цвета». И правда, эти удивительные растения поражают невероятным разнообразием оттенков! А почему цветы разного цвета? И почему другие части растения  окрашены именно так? За цвет отвечают флавоноиды – органические соединения, имеющиеся в огромном количестве в каждом растении. Именно их сочетания и комбинации придают растению его неповторимый вид и оттенок. Понятно, что они носят абсолютно утилитарный характер, то есть, созданы не только для того, чтобы мы с вами любовались их красотой, а для чего же? Природа наградила нас необычайным даром – цветовым зрением, а вместе с ним дала возможность восхищаться красотой окружающего растительного мира. Мы с надеждой смотрим на нежную зелень весенней листвы и с грустью любуемся желто-оранжевой гаммой осеннего леса. Но с какими же процессами в клетках растений связаны эти изменения….? Почему окружающие растения окрашены именно так, а не иначе, как возникает огромное богатство цветов и оттенков? Почему цветок утром розовый, а к вечеру уже синий? Почему в одном соцветии встречаются венчики цветков с различной окраской – от белой до розовой? Эти и другие подобные вопросы задает пожалуй каждый человек, но в школьном курсе биологии мы в основном встречаемся только с одним из растительных пигментов – зеленым хлорофиллом, а как же остальные? Как человек может применить знания о цвете растений в повседневной жизни, где в лабораторных условиях можно использовать переходы цветов растений? Именно ответы на эти вопросы я постаралась получить выполняя данный проект.

 цель работы заключается в  изучение флавоноидов растительных клеток и выяснение возможности их использования в качестве кислотно – щелочных индикаторов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выяснить от чего зависит окраска растительных клеток
2.  Какое  биологическое значение имеет окраска растений
3. Проанализировать строение и свойства антицианов и их возможного использования в качестве индикаторов
4. Опытным путем извлечь антоциановые пигменты из растительного сырья
5. Определить эффективность антоцианов и их комплексных солей в качестве кислотно-основных индикаторов.

1.1 Механизм действия и биологическое значение растительных пигментов

Три антоциана — основные пигменты, от которых зависит окраска цветков многих покрытосеменных: пеларгоидин (красный), цианидин (фиолетовый) и дельфинидин (синий). Родственные им соединения флавонолы — желтые или кремовые, а каротиноиды — красные, желтые или оранжевые. Бетацианины (беталаины) — красные пигменты, которые встречаются в одной из групп двудольных. Смешение этих разных пигментов при разных рН в клетках образует всю гамму окрасок цветка покрытосеменных. Изменение окраски цветка является сигналом для опылителей, сообщающим о том, какие цветки раскрылись недавно, т. е. с большей вероятностью содержат пищу. Все разнообразие окрасок цветков обеспечивается очень малым набором пигментов. Красная, желтая и оранжевая обусловлена каротиноидами, похожими на те, что присутствуют в листьях. Однако, главными пигментами цветков являются флавоноиды. В листьях они задерживают ультрафиолетовую радиацию, разрушительно действующую на нуклеиновые кислоты и белки, и обычно избирательно поглощают сине-зеленые и красные лучи, которые важны для фотосинтеза.
Один из крупнейших классов флавоноидов — антоцианы — играет ведущую роль в определении окраски цветков. К ним относится большинство красных и синих растительных пигментов. Они растворимы в воде и содержатся в вакуолях. Каротиноиды, напротив, растворимы в жирах, и содержатся в пластидах. Цвет антоцианового пигмента зависит от кислотности клеточного сока в вакуолях; например, цианидин — красный в кислой среде, фиолетовый — в нейтральной и синий — в щелочной. У некоторых растений окраска цветка меняется после опыления, обычно за счет антоцианов, делающих их менее заметными для насекомых.
Флавонолы, — другая группа флавоноидов, также очень часто содержатся в листьях и цветках. Многие из них вообще почти бесцветны, но могут придавать цветкам оттенок слоновой кости или белизны.
У всех покрытосеменных растений характерная пигментация цветка зависит от смешения в разных пропорциях флавоноидов и каротиноидов, клеточного рН, а также структурных, то есть отражательных, способностей тканей.
Яркая осенняя окраска листьев связана с превращением больших количеств бесцветных флавонолов в антоцианы при разрушении хлорофилла.
Цветок калужницы болотной выглядит целиком желтым. При этом периферическая часть лепестков, отражающая ультрафиолетовые лучи, окрашена каротиноидами, а поглощающая их центральная часть кажется нам желтой из-за присутствия флавоноида халькона. Для пчел и других насекомых цвет наружной части лепестков будет смешанным желто-ультрафиолетовым (так называемый «пчелиный пурпурный»), а неотражающей центральной — чисто желтым. Чаще всего, хотя и не всегда, способность цветков отражать ультрафиолет связана с присутствием каротиноидов, т. е. ультрафиолетовый узор более присущ желтым цветкам.

1.2 Химизм образования цвета пигментов

Чтобы понять, как устроен мир Роберт  Бойль, английский естествоиспытатель 17 века, провел тысячи опытов, и вот один из них. В лаборатории горели свечи, в ретортах что-то кипело, в это время в кабинет  к  Бойлю  вошел  садовник .Он принес корзину с  красивыми фиалками. Бойль очень любил цветы, он взял несколько цветков, понюхал и положил их на стол. Его  лаборант  Уильям  сообщил  Бойлю,  что  вчера  доставили   две  бутылки  соляной  кислоты  из  Амстердама.  Бойлю  захотелось  взглянуть  на  эту  кислоту, и,  чтобы  помочь  Уильяму  налить  кислоту,  он  положил  фиалки  на  стол.  Затем  он  взял  со  стола  букет  и  отправился  в  кабинет.  Здесь  Бойль  заметил,  что  фиалки  слегка  дымятся  от  попавших  на  них  брызг  кислоты.  Чтобы  промыть  цветы,  Бойль  опустил  их  в  стакан  с  водой.  Через  некоторое  время  он  бросил  взгляд  на  стакан  с  фиалками,  и  случилось  чудо:  тёмно-фиолетовые  фиалки  стали  красными. Так ученый-Роберт Бойль   обнаружил,  что    кислоты  окрашивают  лепестки  фиалок  в  красный  цвет. Затем Бойль заинтересовался, что покажут не фиалки, а другие растения. Эксперименты следовали один за другим. Лучшие результаты дали опыты с лакмусовым лишайником. Тогда Бойль опустил в настой лакмусового лишайника обыкновенные бумажные полоски. Дождался, когда они пропитаются настоем, а затем высушил их. Эти хитрые бумажки Роберт Бойль назвал индикаторами, что в переводе с латинского означает «указатель», так как они указывают на среду раствора. В настоящее время на практике широко применяют следующие индикаторы: лакмус, фенолфталеин, метиловый оранжевый.

Кислотно-основные – это органические соединения, способные изменять цвет в растворе при изменении кислотности.

 Кислотно-основные индикаторы можно найти среди природных объектов. Пигменты многих растений способны менять цвет в зависимости от кислотности клеточного сока. Следствие, пигменты являются индикаторами, которые можно применить для исследования кислотности других растворов. Флавоноиды (от лат. flavus - желтый) – группа природных биологически активных соединений – производных бензо-гамма-пирона, в основе которых лежит фенилпропановый скелет. Это гетероциклические соединения с атомом кислорода в кольце.

- Кольцо А синтезируется из трёх активированных молекул малоновой кислоты.

- Кольцо В (см. рис.1) и примыкающий к нему трёхуглеродный фрагмент (атомы С-2, С-3 и С-4 и О, образующие кольцо С) синтезируются из шикимовой кислоты и фосфоенолпировиноградной кислоты с промежуточным образованием через фенилаланин-коричную кислоту.

Рис. 1. Общая структура флавонов (имена ароматических колец: А - С - В).

Производными этих веществ являются катехины, бетацианины, антоцианы и антоцианидины. Антоцианы – общее название флавоноидного пигмента. Они состоят из углевода (сахара) и агликона – неуглеводной составляющей, в качестве которого у антоцианов выступают антоцианидины – 2-фенилхромены, кроме того, во многих случаях они имеют ацильную группу (рис. 2).

Рис. 2. Структурные формулы антоциана и антоцианидина.

Наиболее распространенными являются цианидин, дельфинидин, пеонидин

                                                                                                         Таблица 1

 Типичные представители антоцианов.

Цвет антоцианидинов является рН зависимым. Антоцианидиновая система претерпевает различные молекулярные преобразования, связанные с изменением рН. В водных растворах существует пять молекулярных видов химического равновесия антоцианидинов: красная пирилиевая соль, бесцветное псевдооснование, синяя хиноидная форма, пурпурный фенолят хиноидной формы, жёлтый халкон (рис. 3).

Рис. 3. Пять молекулярных видов химического равновесия антоцианидинов.

На кислых рН = 1-3, антоцианидин существует преимущественно в виде красной пирилиевой соли. Увеличение рН приводит к снижению интенсивности цвета, так как первая форма подвергается гидратации, вследствие которой получается бесцветная. Из-за нуклеофильной атаки воды на 2-положение антоцианидинового скелета и быстрой потери протона у флавилиевых катионов равновесие смещается в сторону синей хиноидной формы при рН <7 и к пурпурному феноляту хиноидной формы при рН <8. При дальнейшем увеличении рН получается светло-желтый халкон. Данное превращение происходит за счет открытия центрального кольца. Цвет щелочным растворам могут быть возвращены путем изменения рН к кислой. Антоцианидиновая форма равновесия переход к равновесию, где концентрация красных ионов флавилиевого катиона преобладает. Однако, если значение рН слишком высоко и неустойчивая ионная форма халкона уже сформирована, восстановление в форму красной пирилиевой соли не может быть достигнуто путем простого повторного подкисления. В этом случае халкон преобразуется в дикетон за счет кето-енольной таутомерии (рис. 4).

 Рис. 4 Общая схема преобразования халкона.

Хорошо известно, что некоторые металлы, такие как Fe ^{3 +} и Al ^{3 +} образуют стабильные глубоконасыщенные цветные координационные комплексы с антоцианами, которые несут дигидроксифенил структуры в орто-положении B-кольца (рис.5).  Рис.5. Пример комплекса, образованного металлами и антоцианами.

 Это приводит к батохромным сдвигам2 в их спектрах поглощения. Комплексы тоже являются pH зависимыми. Они принимают участи как в образовании цветных, так и бесцветной формы. Таким образом, различные факторы, включая концентрацию и природу антоцианидинового, антоцианидинового равновесия формы, степени гликозилирования антоцианов, ацилирование, природа и концентрация пигментов, металлические комплексы, внутри- и межмолекулярных механизмы ассоциации – влияют на изменение цвета и его насыщенность.

Главная роль антоцианов в образовании цвета в цветках растений – привлечение опылителей. В плодах же – для привлечения внимания животных, которые могут съесть их и тем самым помочь в распространении семян. В фотосинтетических тканях (таких как листья) антоцианы имеют "солнцезащитную" функцию, поглощая сине-зеленый и ультрафиолетовый свет, защищая ткани от фотоингибирования. В клетке антоцианы расположены в вакуолях. Увеличение вакуолярной рН в лепестках цветов связано с активным транспортом Na⁺ и/или K⁺ из цитозоля в мембрану вакуоли через натрий-калиевый канал. Эта систематическая транспортировка ионов поддерживает слабощелочную рН вакуоли, производя небесно-голубые лепестки.

Катехины – полифенольные соединения в составе чая. Типичные представители – танины. Также меняют свою окраску в зависимости от различных значений pH. В кислой среде они светлеют, в щелочной – темнеют.

Близкие по окраске к антоцианам пигменты бетацианины (betterave – свекла (фр.)) никогда не встречаются вместе с антоцианами в одних и тех же растениях. Структура бетацианинов долгое время не поддавалась расшифровке и была одной из самых загадочных тайн биохимии растений. Несмотря на сходство в окраске, хромофорный фрагмент бетацианинов совершенно не похож на хромофор антоцианов, хотя тоже имеет положительный заряд. Бетацианины очень хорошо растворимы в воде и более устойчивы, чем антоцианы. Наиболее известный источник бетацианинов – обычная столовая свекла.

Часть 2 – Практическая часть.

Цель экспериментальной части – извлечь антоциановые пигменты из растительного сырья, определить эффективность антоцианов и их комплексных солей в качестве кислотно-основных индикаторов.

2.1  Выделение антоцианов

 Антоцианы содержатся в вакуолях клеток растений, где поддерживается постоянный pH. Для того чтобы получить индикатор требуется извлечь их из клетки. Существует несколько способов сделать это: с помощью механического воздействия (разрезать), с помощью теплового шока (отварить), с помощью экстрагирования (лучше всего использовать полярный растворитель, нами были опробированы спирт, четырехлористый углерод и муравьиная кислота ).

В качестве сырья лучше всего использовать лепестки или зрелые плоды. В то же время можно использовать заготовленные на зиму варенья, компоты, которые сохраняют окраску раствора, например, черную смородину, малину. Некоторые сорта чая тоже являются индикаторами. Неплохо подходят различные соки (желательно свежеприготовленные), например, из винограда (Конкорда или мускатного) или вишни.

К сожалению, из-за неустойчивости антоцианов, отвары быстро плесневеют и скисают, поэтому готовить такие индикаторы надо непосредственно перед работой с ними. Ниже приведены несколько методик апробированных нами для получения подобных растворов.

1)Взять немного запасенного сырья (точное количество не имеет значения), положить в пробирку, налить воды, поставить на водяную баню и нагревать до тех пор, пока раствор не окрасится. Каждый раствор после охлаждения необходимо профильтровать и слить в

приготовленную заранее чистую склянку с этикеткой.

2)Взять немного запасенного сырья (в данном случае лепестков), растолочь их в ступке и экстрагировать в этиловом спирте, уайт-спирите или муравьиной кислоте. Полученный раствор профильтровать и слить в заранее подготовленную чистую подписанную пробирку.

Так же можно изготовить индикаторную бумагу, пропитав полоски фильтровальной бумаги растворами полученных экстрактов. Для более точного определения полученный при нанесении капли раствора цвет индикаторной бумаги необходимо немедленно сравнить с эталонной цветовой шкалой.

Кроме того для использования индикаторов из природного сырья нужно знать, что некоторые индикаторы можно использовать только один раз, так как после первого же изменения разрушаются и перестают реагировать (цветки кипрея), а другие – многократно (к примеру, экстракт цветов колокольчика).

Сырьем для извлечения антоцианового красителя служили измельченные ягоды клюквы, плод свеклы, краснокочанной капусты, морковный и вишневый сок, варенье из клюквы, листья черного чая, соцветия каркаде. В качестве экстрагентов применяли дистиллированную воду, так как подобный экстрагент в отличии от спирта давал более точный результат.

Навеску сырья массой 10 г погружали в дистиллированную воду объемом 120 см³ . Полученные экстракты фильтровали с помощью фильтровальной бумаги и полученный фильтрат наливали в заранее подготовленную колбу.

2.2 Определение эффетивности антоцианов как кислотно – щелочных индикаторов

Определение эффективности индикатора – аналитическая реакция, которую необходимо проводить при строго определенном значении pH, которое должно сохраняться в течении всего процесса проведения реакции. Для сохранения постоянного значения pH были применены буферные растворы. Нами был использован универсальный буферный раствор (т.е. буферный раствор, обладающий большой буферной емкостью) из H₃PO₄, CH₃COOH, H₃BO₃, молярность 0,04 моль/л, концентрация кислот 100%. Данный раствор имеет буферную емкость от pH = 2 до pH = 12. [Лурье]

Расчеты для буферных растворов:

При расчете на 0,1 л буферного раствора имеем:

m (H₃PO₄) = 0,04 моль/л * 0,1л * 98 г/моль = 0,392 г
m (CH₃COOH) = 0,04 моль/л * 0,1л * 60 г/моль = 0,240 г
m (H₃BO₃) = 0,04 моль/л * 0,1л * 62 г/моль = 0,248 г

В качестве титранта использовался NaOH молярностью 0,2 моль/л.

m (NaOH) = 0,2 моль/л * 0,1 л * 40 г/моль = 0,8 г.

Для приготовления буферных растворов мы использовали смесь кислот. С помощью весов отмерили необходимую, согласно расчетам, массу кислот, смешали их в мерном стакане с 0,1 л дистиллированной воды. К полученному раствору добавили необходимое количество NaOH (см. таблицу 2). Затем взяли аликвоту (10 мл) полученного буферного раствора.

Таблица 2

 Расчетная таблица для приготовления буферных растворов

1.Каркаде (гибискус).

Образец соцветий гибискуса экстрагировали горячей водой водой. Добавили в пробирки по 0,5 мл буферного раствора и 0,8 мл полученного экстракта. Наблюдали изменение цвета (рис. 8).

Рис. 8. Изменение окраски экстракта гибискуса в зависимости от различных значений pH.

2. Свекла.

Плод свеклы измельчили на терке и экстрагировали горячей водой. Добавили в пробирки по 0,5 мл буфера и 0,8 мл полученного раствора. Наблюдали изменение цвета (рис. 9).

Рис. 9. Изменение окраски экстракта свеклы в зависимости от различных значений pH.

3. Чай черный.

Образец листьев черного чая экстрагировали водой (температура 85 градусов Цельсия) в течение 5 мин. Добавили в пробирки по 0,5 мл буферного раствора и 0,8 мл полученного экстракта. Наблюдали изменение оттенка исходного цвета (рис. 10).

Рис. 10. Изменение окраски экстракта чая в зависимости от различных значений pH.

4. Сок вишневый.

Сок разбавили дистиллированной водой в 10 раз. Добавили в пробирки по 0,5 мл буфера и 0,8 мл полученного раствора. Наблюдали изменение цвета (рис. 11).

Рис. 11. Изменение окраски экстракта вишни в зависимости от различных значений pH.

5. Сок морковный.

Сок разбавили дистиллированной водой в 10 раз. Добавили в пробирки по 0,5 мл буфера и 0,8 мл полученного раствора. Изменения окраски не наблюдали (рис. 12).

Рис. 12. Окраска экстракта моркови при различных значениях pH.

6. Клюква.

Экстрагировали при кипячении. Добавили в пробирки по 0,5 мл буфера и 0,8 мл полученного раствора. Наблюдали изменение цвета (рис. 13).

Рис. 13. Изменение окраски экстракта клюквы в зависимости от различных значений pH.

8. Краснокочанная капуста.

Образец листьев краснокочанной капусты мелко порезали и экстрагировали при нагревании. Добавили в пробирки по 0,5 мл буфера и 0,8 мл полученного раствора. Наблюдали изменение цвета (рис. 14).

Рис.14. Изменение окраски экстракта краснокочанной капусты в зависимости от различных значений pH.

ОБСУЖДЕНИЕ И ВЫВОДЫ

Конечно же, если растения окрашены, значит, в них есть красители – пигменты. Растительные пигменты являются предметом исследования многих научных дисциплин. Предмет физической химии – выделение пигментов из растений и определение их химического строения, биохимия исследует процессы, приводящие к образованию окрашенных веществ, физиология растений  их локализацию и миграцию в органах растений, хемотаксономия использует наличие разных пигментов для классификации растений и т.д. В ходе проведения работы я изучила научную и научно-познавтельную  литературу, посвященную описанию строения и свойств пигментов растительной клетки. Опытным путем выделила антоциановые пигменты из растительного сырья и доказала эффективность использования их комплексных солей  в качестве кислотно - щелочных индикаторов.

В результате проведения аналитических реакций мы наблюдали изменение окраски экстрактов в зависимости от различных pH. Тем самым мы доказали то, что возможно их применение в качестве кислотно-основных индикаторов. Главными отличиями от синтетических индикаторов является то, что они не имеют четких границ перехода, цвет меняется постепенно, проходя через промежуточные фазы. Экстракты из свежего сырья показали большую эффективность вследствие того, что полученные из него пигменты не подвергались никакой дополнительной обработке, кроме того в подобном сырье их гораздо больше, так как антоцианы являются неустойчивыми соединениями и со временем разрушаются. По этой же причине приготавливать подобные индикаторы нужно непосредственно перед работой с ними.

- Природные индикаторы  можно использовать на уроках химии, элективных курсах.

- Результаты исследовательской работы могут пригодиться  в садоводстве, например, для выращивания цветов с более насыщенной окраской.

- Результаты исследовательской работы можно использовать для определения рН (водородный показатель) различных растворов, например, молочных продуктов, бульонов, лимонада и других, а также для определения кислотности почвы, так как на одной и той же почве в зависимости от ее кислотности один вид растений может давать высокий урожай, а другие будут угнетенными.

Выводы:

1. Окраску растительным клеткам придают флавоноиды – группа природных биологически активных соединений – производных бензо-гамма-пирона, в основе которых лежит фенилпропановый скелет. Цвет антоцианового пигмента зависит от кислотности клеточного сока в вакуолях.

2. Главная роль антоцианов в образовании цвета в цветках растений – привлечение опылителей. В плодах же – для привлечения внимания животных, которые могут съесть их и тем самым помочь в распространении семян. В фотосинтетических тканях (таких как листья) антоцианы имеют "солнцезащитную" функцию, поглощая сине-зеленый и ультрафиолетовый свет, защищая ткани от фотоингибирования.

 3. Антоцианы можно использовать в качестве кислотно-основных индикаторов

4.Антоциановые пигменты были извлечены  с помощью механического воздействия, теплового шока и экстрагирования (с использованием  полярных растворителей этилового спирта, четырехлористого  углерода и муравьиной кислоты ).

5.  Наибольшую эффективность и показательность имеет экстракт из каркаде (гибискус) и краснокочанный капусты.  Полученные индикаторы не имеют четкой границы перехода вследствие своего сложного состава.

Вникнув в проблему, я поняла, что она далеко не нова, но вместе с тем открыла для себя огромное множество удивительных фактов, овладела методикой работы по экстракции и титрованию, научилась делать тончайшие срезы при изготовлении микропрепаратов.  Работа над проектом позволила мне еще раз убедиться в своей любви к биологии и химии.

Список литературы:
      1. Артамонов В.И. Занимательная физиология растений. – М.:   Агропромиздат, 1991.

1. Бетацианины корнеплодов красной столовой свеклы /И.И. Саенко, О.В. Тарасенко, В.И. Дейнека, Л.А. Дейнека//Научные ведомости Белгородского государственного университета.-2012 - №3- стр 194-199
2. Бердоносов С.С., Бердоносов П.С. Справочник по общей химии/. – М.: АСТ Астрель, 2002.
3. Детская энциклопедия/ – М.: Академия педагогических наук РСФСР, 1959.
4. Заленский О.В. Эколого-физиологические аспекты изучения фотосинтеза / Тимирязевские чтения. – Л.: Наука, 1977. Вып. 37. 57 с.
5. Карцова А.А.. Химия без формул или знакомые незнакомцы /Авалон, Азбука-классика, СПб.-2005.
6. Лебедева Т.С., Сытник К.М. Пигменты растительного мира./ – Киев: Наукова думка, 1986.
7. Лурье Ю.Ю.. Справочник по аналитической химии. М. Химия. - 1971.

1. Ольгин О. Опыты без взрыва./ – М.: Химия, 1986.
2. Пчелов А.М. Природа и ее жизнь./ – Л.: Жизнь, 1990.
3. Anthocyanins as pH-Indicators and Complexing Agents. Peter Keusch. www.demochem.de/p26_anth-e.htm
4. http://ru.wikipedia.org/wiki/Антоцианы
5. http://fb.ru/article/71682/hotite-uznat-pochemu-tsvetyi-raznogo-tsveta